转基因番茄防龋疫苗的基础研究
Ⅰ.变形链球菌pac基因唾液粘附区植物表达质粒的构建

［摘要］ 目的：构建变形链球菌表面蛋白基因（pac）唾液粘附区的植物表达质粒pROP1和pRPB1。方法：用PCR扩增的含变形链球菌表面蛋白唾液粘附区P1片段（184－1946bp）与植物的高效表达质粒pROKCP结合，构建pROP1表达质粒；且将此质粒与Bar基因（抗除草剂基因）连接，构建表达质粒pRPB1，酶切电泳检测。结果：从pPC41中扩增的P1片段整合到pROKCP的适当部位，构成重组质粒pROP1,从pPBar分离出的Bar基因整合到pROP1，构成重组质粒pRPB1。结论：本实验成功地构建了携带变形链球菌表面蛋白唾液粘附区的植物表达质粒pROP1和pRPB1。
［关键词］ 植物表达质粒；　表面蛋白基因；　唾液粘附区

　　转基因植物技术是随DNA重组、基因的遗传转化、植物的组织培养、目的基因的整合与表达的检测等技术手段的建立而发展起来的生物技术。本研究是将变形链球菌表面蛋白基因唾液粘附区(saliva-binding region, SBR)与植物的高效表达质粒相连接，以番茄作为生物反应器来表达表面蛋白抗原的唾液粘附区。

材料与方法

　　1. 质粒与菌种。pROCP质粒（Kmr）、pPBar质粒（Kmr）、大肠杆菌TOP10、大肠杆菌DH5а由中山大学生命科学学院生物工程中心惠赠。pPC41 质粒由美国Okahashi教授惠赠。pGEM-T easy 载体 （Ampr）购于美国Promega公司。大肠杆菌常规于Luria

　　
-Bertani肉汤或琼脂中生长，根据所含质粒的耐药性在培养基中加适量抗生素。
　　2. 试剂与引物。Wizard PCR纯化试剂盒购于美国Promega公司，DNA 凝胶纯化试剂盒购于美国Sigma公司。其余化学纯试剂由实验室提供。引物由上海生物工程中心合成。引物1：5′gga tcc cag att tgg agg att tat gaa agt c 3′, 引物2: 5′ggt acc tca acc agc cag ctt tat cac c 3′。
　　3. DNA操纵。采用梯度PCR仪扩增P1片段，产物用Wizard PCR纯化试剂盒回收。PCR产物与pGEM-T easy载体连接形成pTP1质粒，连接酶与连接缓冲液由厂商配制。利用α互补现象和小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析筛选阳性克隆。从大肠杆菌中提取质粒按碱裂解法（1）。DNA定量采用紫外分光法。限制性内切酶酶切根据厂家说明选用缓冲液。DNA电泳用0.8 %琼脂糖凝胶电泳，从0.8%琼脂糖凝胶中提取目的DNA片段采用Sigma DNA 凝胶纯化试剂盒。DNA片段粘端连接采用T4 DNA连接酶，连接缓冲液按厂商要求配制。线状质粒DNA的去磷酸化采用Sambrook（1）等法。连接产物于4℃下过夜。
　　4. 转化。感受态大肠杆菌按氯化钙制备，制备后于-70℃保存。用前缓慢解冻，立即使用。大肠杆菌转化按热刺激法［1］进行。根据细菌耐药性挑选重组质粒。

结　果

　　一、PCR 扩增唾液粘接区P1片段及产物纯化结果
　　利用合成引物1和引物2在设立的各项参数下扩增P1片段，电泳检测只见一条1.76kb 的DNA带，本实验以HindⅢ、EcoRⅠ双酶切Marker作对照检测片段的大小及紫外分光法测定DNA的浓度约200ng/ul。PCR扩增的片段经PCR纯化试剂盒回收符合克隆条件。（图1）

　　图1　唾液粘附区基因的PCR扩增产物
A　HindⅢ/EcoRⅠMarker
B　唾液粘附区基因的PCR扩增产物

　　图2　pROP1和pRPB1质粒的构建
A　pROP1质粒BamHⅠ和KpnⅠ酶切片段
B　pRPB1质粒HindⅢ酶切片段
C　HindⅢ/EcoRⅠMarker

　　二、pROP1和pRPB1质粒的构建
　　pTP1用BamHⅠ和KpnⅠ酶切，分离纯化P1片段（1.76kb），将其与经BamHⅠ和KpnⅠ消化后的pROKCP连接，重组质粒为pROP1。pPBar质粒经HindⅢ消化，分离提纯Bar基因（3 kb），将Bar基因与经HindⅢ消化且去磷酸化的pROP1连接，重组质粒为pRPB1。酶切鉴定pROP1和pRPB1（图2）。pROP1质粒用BamHⅠ和KpnⅠ消化后电泳检测有两条带分别是6 kb和1.76 kb，pRPB1质粒用HindⅢ消化后电泳检测有

讨　论

　　一、关于转基因植物生产疫苗
　　利用转基因植物作为生物反应器，将外源基因引入植物内，以生产药用多肽和医用疫苗，这是继转基因动物之后近年来新兴的研究领域。用植物生产疫苗有其它生产系统不可比拟的优点：①　易于形成产业化规模，在筛选到高表达植株后，只需增加耕种面积就能大规模生产；②　价格便宜。因为植物易于栽培和管理，较目前动物或酵母菌生产疫苗的方法更有利于降低成本，对发展中国家来说有广泛的应用前景；③　安全。植物病毒不会感染人类，使污染了疫苗制品，也不会象动物病毒伤害人类；④　使用方便。转基因植物疫苗采取口服的方式接种，不需纯化和注射，更易被人们所接受。
　　植物遗传转化技术的发展带动了对植物基因表达外源抗原的研究。自从1990年第一例利用植物表达系统生产口服疫苗的报告在国际专利合作公约出现后，越来越多的学者注重于转基因植物生产疫苗的研究。1995年和1998年Arntzen研究小组分别报道了鼠及人群在口服转基因植物后，可在体内产生主动免疫反应来防治大肠杆菌和霍乱弧菌引起的腹泻［2，3］。因为目前多使用的植物如马铃薯等必须经过热加工后方可食用，烹调过程中会破坏其中的疫苗有效成分，番茄营养丰富且可无须热加工直接食用或制成番茄酱，因此本课题选择番茄做为生物反应器，研制携带变形链球菌表面蛋白SBR基因的转基因番茄的防龋疫苗。
　　二、唾液粘附区植物表达载体的构建
　　变形链球菌是龋病的主要致病因子，其表面蛋白抗原是毒力因子，大约180－210Kda。来自变形链球菌的抗原AgⅠ/Ⅱ在细菌和吸附在牙面的唾液糖蛋白（salivary glycoproteins, SGPs）之间起作用［4，5］，可能作为一种粘附因子［6，7］。对AgⅠ/Ⅱ全分子的S－IgA抗体能抑制变形链球菌的粘附、克隆和龋病的发展［7，8］。说明表面蛋白抗原具有粘附区，从而能够引起细菌的聚集、细菌与牙面的粘附以及细菌在牙面的克隆。目前的研究发现这个粘附因子含两个粘附区：N端富丙氨酸区及中间富脯氨酸区，这两个区域在种属间具有高度的保守性。Brady等［9］报道P1蛋白的富丙氨酸区参与液态唾液凝集素介导的链球菌凝集，与凝集素覆盖的羟磷灰石结合的位点可能位于中间和C末端区。然而Crowly等［10，11］研究发现P1蛋白的富丙氨酸区是直接与唾液凝集素作用的重要区，以及这种作用干扰细菌的粘附和凝集机制。Hajshengallis 等［12］研究发现SBR与霍乱弧菌B亚单位的嵌合蛋白能引起长时间的抗AgⅠ/Ⅱ的唾液IgA和血清IgG反应，甚至在佐剂缺乏时。Moisset A等［13］报道与唾液糖蛋白作用的区域位于N末端，用AgⅠ/Ⅱ的唾液素粘附区多肽免疫的机理是刺激抗体提高特异性凝集作用，有助于唾液凝集素介导的口腔链球菌的非免疫性清除。
　　Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性的活性，能在双链DNA分子的3′末端添加一个A。本实验采用的pGEM-T easy 载体是利用Taq DNA聚合酶的这种特性设计的一种3′末端突出单个T的线性质粒，是一种中间载体。根据T－A互补的原理，PCR产物可以直接连接到载体上,从而进一步利用共同的酶切位点将目的基因转移到植物表达质粒。pROKCP是转基因植物技术中较好的中间质粒，它是由pROKⅡ插入一个带植物病毒CaMV的35S启动子、终止子和多酶切位点的片段构建而成。35S启动子能使外源基因在植物细胞中表达，并且表达量异常高。P1片段保留唾液粘附区的前端信号肽，以便能通过信号肽的引导穿过细胞壁转入到胞外。pROP1是pROKCP质粒与P1片段结合的产物，其中含有卡那霉素的抗性基因，有助于组织培养过程中所需植株的筛选。虽然pROP1的抗性基因已经能够作为筛选的标志，但是，如果pROP1加上抗除草剂基因（Bar）构成pPRB1质粒更加增强筛选的强度，Bar基因有利于植株移植土壤后起抗除草剂的作用。至此，本课题已成功的构建了变形链球菌表面蛋白唾液粘附区的植物表达质粒，为下一步构建农杆菌载体打下基础。

两条带分别是7.76 kb和3 kb.作者简介］　蒋少云(1972～)，女，湖南人，硕士，专业方向为牙体牙髓病学。
蒋少云（中山医科大学口腔医学院，　广东　广州　510120）
凌均启（中山医科大学口腔医学院，　广东　广州　510120）

参考文献

［1］　Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T. Molecular cloning:a laboratory manual. 2 nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1989
［2］　Haq TA, Mason HS, Clements JD, et al. Oral immunization with a bacterial antigen produced in transgenic plants. Science, 1995, 268(5):714～716
［3］　Tacket CO, Mason HS, Losonsky G, et al. Immuno-genicity in humans of recombinant bacterial antigen delivered in transgenic potato. Nature Medicine, 1998, 4(5):607～609
［4］　Demuth DR, Golub EE and Malamud D. Streptococcal-host interactions. Structural and functional analysis of a Streptococcus sanguis receptor for a human salivary glycoprotein. J Biol Chem， 1990,265(13):7120～7126
［5］　McBride BC, Kelly CG, Munro G, et al. Conservation of the gene encoding streptococcal antigen Ⅰ/Ⅱ in oral streptococci. Infect Immun，1991,59(8):2686～2694
［6］　Douglas CWI and Russell RRB. Effct of specific antisera upon Streptococcus mutans adherence to saliva-coated hydroxylapatite. FEMS Microbiol Lett，1984,25(1):211～214
［7］　Hajishengallis G, Nikolova E and Russell MW. Inhibition of Streptococcus mutans adherence to saliva-coated hydroxylapatite by humans secretory immunoglobulin A(S-IgA):antibodies to cell surface protein antigen Ⅰ/Ⅱ:reversal by IgA1 protease cleavage. Infect Immun，1992,60(12):5057～5064
［8］　Katz J, Harmon CC, Buckner GP, et al. Protective salivary immunoglobulin A responses against S.mutans infection after intrnasal immunization with S. mutans antigenⅠ/Ⅱcoupled to the B subunit of cholera toxin. Infect Immun，1993,61(5):1964～1971
［9］　Brady LJ, Piacentini DA , Crowley PJ, et al. Differentiation of salivary agglutinin-mediated adherence and aggregation of mutans streptococci by use of monoclonal antibodies against the major surface adhesin P1. Infect Immun，1992,60(3):1008～1017
［10］　Crowley PJ, Brady LJ, Piacentini DA, et al. Indentification of a salivary agglutinin-binding domain within cell surface adhesin P1 of Streptococcus mutans. Infect Immun，1993,61(4):1547～1552
［11］　Hajishengallis G, Koga T and Russell MW. Affinity and specificity of the interactions between S. mutans antigen Ⅰ/Ⅱ and salivary components. J Dent Res，1994,73(9):1493～1502
［12］　Hajishengallis G, Michalek SM and Russell MW. Persistence of serum and salivary antibody response after oral immunization with a bacterial protein antigen genetically linked to the A2/B subunit of cholera foxin. Infect Immun，64(2):665～667
［13］　Moisset A, Schatz N, Lepoivre Y, et al. Conservation of salivary glycoprotein-interacting and human immuno- globulin G-cross reactive domains of antigenⅠ/Ⅱ in oral streptococci.Infect Immun，1994,62(1):184～193